支气管肺泡灌洗液行 Xpert 与 tNGS 检测在肺结核诊断中的对比研究

媛 徐(松阳县人民医院，中国)
冀宏 李(松阳县人民医院，中国)
才生 许(松阳县人民医院，中国)

摘要

探讨临床诊断肺结核患者，痰找抗酸杆菌及痰结核分枝杆菌rpoB基因和耐药性实时荧光定量核酸扩增检测 (Xpert)均阴性的情况下，支气管肺泡灌洗液（BALF）行Xpert检测和病原微生物靶向测序检测（tNGS）对肺结核的诊断价值。方法回顾性分析2022年1月至2025年4月松阳县人民医院收治的65例痰找抗酸杆菌及痰Xpert均阴性、肺部影像学考虑肺结核的患者，对其BALF同时进行Xpert和tNGS检测，比较两种技术的检出率及临床特征。结果 tNGS对结核分枝杆菌复合群（MTBC）的检出率（58/65, 89.23%）显著高于Xpert（37/65, 56.92%），P值＜0.001，且tNGS额外检出3例非结核分枝杆菌（NTM）。两种技术联合应用可覆盖95.4%的阳性病例。结论 tNGS在BALF检测中对肺结核的诊断效能优于Xpert，尤其适用于肺结核感染早期、低载量感染及复杂病例如NTM的鉴别诊断。关键词支气管肺泡灌洗液；Xpert检测；tNGS检测；肺结核；临床诊断病例【作者简介】徐媛（1972-），女，中国松阳人，本科，中级（主治医师），从事结核病研究。1 引言肺结核仍是全球主要的传染病之一，是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的严重危害人类健康的慢性传染病，依然具有高发病率（morbidity）和高死亡率（mortality），尤其在中低收入国家[1]。快速、准确的诊断对于肺结核的有效治疗和防控至关重要。传统的痰涂片抗酸染色及培养方法存在敏感性低、检测周期长等局限性[2]，其灵敏度和特异性也受到一定限制。近年来，随着分子生物诊断技术不断发展，Xpert和tNGS作为新型的快速诊断工具，在结核（TB）的检测中显示出显著的优势。Xpert技术以快速、自动化为优势。Xpert，基于实时荧光定量PCR技术（qPCR），通过GenoType MTBDR试剂盒实现对结核分枝杆菌（MTB）及其抗药性基因的快速检测。该技术的灵敏度可达到85%-95%，特异性为98%-100%，在1小时内可获得结果，显著缩短检测周期。Xpert在资源有限的环境中尤为适用。Xpert也存在一定的局限性，包括对低菌量样本的敏感性不足[3]，以及对非结核分枝杆菌的交叉反应。tNGS通过捕获特定基因片段，可同时检测结核菌及耐药突变，近年在呼吸道感染中应用广泛[4]，2024年，WHO推荐tNGS用于结核分枝杆菌分子药敏检测，通过对临床样本进行高通量测序，不仅能检测结核分枝杆菌，还能开展抗药性全基因组分析，其灵敏度可达到99%，特异性通常大于95%。tNGS能够同时识别多种病原微生物DNA，在临床治疗中具有重要意义。2 资料与方法1病例选择收集2022年1月至2025年4月松阳县人民医院65例临床诊断肺结核患者，女性28例，年龄20~76岁，平均年龄（54.82±18.84）岁；男性37例，年龄19~82岁，平均年龄（64.95±14.19）岁。所有患者均仔细确认病史和体格检查，并通过实验室及影像学等检查诊断。纳入标准：⑴符合《WS288-2017肺结核诊断》中肺结核临床诊断病例标准[5]；⑵痰找抗酸杆菌连续3次阴性；⑶痰Xpert检测均阴性；⑷有咳嗽、咯血等肺结核临床表现；⑸胸部CT显示与活动性肺结核病变。排除标准：⑴排除痰找抗酸杆菌阳性及痰Xpert阳性。本研究经医院伦理委员会审核通过。2.1 检测方法支气管镜检查：采用 Olympus BF - 260 支气管镜行BALF采集。Xpert检测：使用Cepheid GeneXpert系统检测MTBC DNA及利福平耐药性。按照说明书操作，检测下限为131CFU/ml。半巢式全自动实时荧光定量PCR检测（XpertMTB/RIF）采用GeneXpert检测系统，是一种半巢式实时荧光PCR体外诊断技术，可对结核分枝杆菌以及利福平耐药性进行检测。进而用于诊断患者是否结核以及是否对利福平耐药（rpoB序列存在突变）Xpert，该技术的灵敏度可达到85%-95%，特异性为98%-100%，在1小时内可获得结果，显著缩短检测周期。Xpert在资源有限的环境中尤为适用。Xpert也存在一定的局限性，包括对低菌量样本的敏感性不足，以及对非结核分枝杆菌的交叉反应。tNGS检测：采用杭州艾迪康医学tNGS病原微生物靶向测序 panel，覆盖MTBC及NTM等300+病原微生物。具体流程：DNA提取使用QIAamp DNA Mini Kit（Qiagen）；数据分析通过生物信息学软件比对至RefSeq数据库。tNGS的结果分析时间通常需要24-48小时，相对Xpert长一点，但它在突发疫情应对、耐药性监测等方面的应用潜力不容小觑。tNGS最大缺点是涉及PCR开管反应，存在污染可能，并且会随着时间积累污染越来越多，在运行中有时会出现假阳性的情况，可以采用一些方法尽量控制。采用采用SPSS 26.0软件进行统计分析。计数资料以例数（%）表示，组间比较采用 χ²检验或Fisher精确检验。χ²检验比较检出率差异，P<0.05为差异具有统计学意义。3 结果MTBC的检出率比较 65例患者中，女性28例（43.08%），男性37例（56.92%），tNGS对MTBC的阳性检出率（58/65, 89.23%）显著高于Xpert阳性检出率（37/65, 56.92%），P值＜0.001，有统计学意义（表1）。表 1 Xpert 和 tNGS 对 MTBC 的检出率比较检测方法阳性例数检出率（%）95%Clχ²P值Xpert3756.92（44.6 , 69.2）17.42＜0.001tNGS5889.23（81.4, 97.0）不同性别Xpert和tNGS对MTBC的检出率比较 65例患者中，女性28例，男性37例，不管男女，tNGS对MTBC的阳性检出率（94.59%,92.86%）都显著高于Xpert阳性检出率（62.16%, 46.43%），P值均＜0.001，有统计学意义（表2）。表 2 不同性别 Xpert 和 tNGS 对 MTBC 的检出率比较性别Xpert阳性率（%）tNGS阳性检出率（%）χ²P值男23/37（62.16）35/37（94.59）11.48＜0.001女13/28（46.43）26/28（92.86）14.28＜0.001不同年龄分层Xpert和tNGS对MTBC的检出率比较65例患者中按年龄分层，大于60岁44例，其中Xpert检出27例MTBC，tNGS检出38例，tNGS阳性检出率（86.36%）高于Xpert阳性检出率（61.36%），P值＜0.01，有统计学意义；小于等于60岁的患者有21例，Xpert检出10例，tNGS检出20例，tNGS阳性检出率（95.24%）明显高于Xpert阳性检出率（47.62%），P值＜0.001，有统计学意义（表3）。表 3 不同年龄分层 Xpert 和 tNGS 对 MTBC 的检出率比较年龄分组Xpert阳性率（%）tNGS阳性检出率（%）χ²P值＞60岁27/44（61.36）38/44（86.36）7.12＜0.01≤60岁10/21（47.62）20/21（95.24）11.67＜0.001支气管镜下不同表现与MTBC检出率 35例（53.85%）支气管正常，22例（33.84%）黏膜炎性改变，8例（13.84%）支气管狭窄/闭塞。在支气管镜正常表现和有粘膜炎性改变时，tNGS阳性检出率分别是（85.71%，90.91%）均高于Xpert阳性检出率（54.29%，45.45%），P值均＜0.01，有统计学意义；在支气管狭窄或闭塞时，tNGS阳性检出率（87.50%）略高于Xpert阳性检出率（75.00%），P值＞0.05，无统计学意义（表4）。表 4 支气管镜下表现与检出率支气管镜表现Xpert阳性率（%）tNGS阳性检出率（%）χ²P值正常19/35（54.29）30/35（85.71）8.23＜0.01黏膜炎性改变10/22（45.45）20/22（90.91）10.48＜0.01狭窄/闭塞6/8（75.00）7/8（87.50）0.41＞0.05联合检测效能。协同检出率：两种技术（Xpert和tNGS）均阳性36例（55.38%）；联合检出率：有3例患者是Xpert和tNGS均未检出，62/65例（95.38%）互补检出率：Xpert单独阳性1例（1.54%）；tNGS单独阳性22例（33.85%），且额外检出3例（4.62%）非结核分枝杆菌（NTM）。4 结语肺结核分疑似病例、临床诊断病例和确诊病例[5]，其中临床诊断病例诊断主要依靠临床表现和胸部影像学，这些存在局限性和不确定性，导致诊断比较困难，也存在误诊率，所以明确诊断尤为重要，而且患者的依从性会更好。支气管镜BALF可以反映肺部炎症和感染的情况，可以做多种检测，为临床诊断肺结核的确诊提供新的思路和方法[8]。支气管镜BALF联合X-pert检测能明显提升临床诊断肺结核的阳性检出率。支气管镜BALF联合tNGS检测诊断临床诊断肺结核敏感度、特异度高[6]。本研究中提示tNGS技术对MTBC的检出率高于Xpert，尤其是支气管镜下表现正常或病变较轻的患者，tNGS更具优势，且tNGS能同步检测其他病原体及非结核分枝杆菌。对于支气管镜下狭窄或者闭塞患者，tNGS检出率（87.50%）虽然高于Xpert（75.00%），但是没有统计学意义。对于此现象，我们考虑可能与病变较轻的患者菌量较少或者分布不均有关。Xpert技术因其快速和高效的特点，能够作为基础医疗单位的常规检测工具，尤其适合在资源匮乏的地区推广。Xpert对利福平耐药的同步检测是其优势，但本研究未涉及耐药分析，需进一步探讨。本研究中Xpert漏检的28例中，17例（60.7%）支气管镜下表现正常，推测亦与结核菌分布不均或载量低有关，因为Xpert的检测下限是131CFU/ml。而tNGS通过多重引物捕获结核菌全基因组，灵敏度较PCR提高10~100倍[7]，在临床诊断未明确、高风险群体筛查、公共卫生监测和科学研究中显示出更大的应用价值，尤其适用于低载量感染。此外，tNGS同时检出肺克雷伯杆菌1例，金黄色葡萄球菌1例，单独检出3例NTM（胞内分枝杆菌、鸟分枝杆菌），提示其在鉴别诊断中的价值，减少误诊率，从而减少使用结核药引起的不良反应和经济损失[8]。综上所述，Xpert与tNGS各具优势，在未来的肺结核诊断中必将发挥更加重要的作用。未来Xpert与tNGS的结合使用必将促进精准诊断和个体化治疗的发展，特别是在涂阴结核的诊断和耐药结核的管理上。本研究中，两种技术联合可覆盖95.38%的阳性病例，提示互补性。在本研究中，tNGS虽然检出效率高，但仍有4例未检出，出现假阴性的结果，可能与湿实验技术问题如破壁困难导致核酸未彻底释放、微生物含量过低、标本采样不规范、存储或运输不当，干实验问题如微生物序列的不完整性、比对数据库未纳入等相关。有1例是Xpert阳性的，另外3例我们做了结核诊断性治疗，均显示治疗有效，进一步提示tNGS也是有假阴性的。本研究表明，肺泡灌洗液Xpert及tNGS技术在肺结核临床诊断病例中具有重要诊断价值。两者联合可提高诊断准确性。临床工作中可根据实际情况选择合适的检测方法，以利于临床诊断肺结核的早期确诊与治疗。随着新技术的不断涌现，优化这些分子诊断方法的临床应用和减少技术间的障碍，必将促进肺结核的早期诊断和治疗。如果能提高Xpert和tNGS的经济性和可及性，将更有利于应对全球结核疫情。参考文献[1] 舒薇，刘宇红.世界卫生组织《2023年全球结核病报告》解读[J].结核与肺部疾病杂志，2024，5（1）：15-19.[2] 齐齐，蔡青山，陈园园，周丽红，等.宏基因二代测序技术对胸内淋巴结结核的诊断价值[J].中国防痨杂志，2024，(S1)：2024.06.30.[3] 张勇，刘姿，李敏，等.靶向二代测序技术在支气管肺泡灌洗液中检测结核分枝杆菌的临床应用［J］.胸腔疾病杂志，2024，16（5）：305-313.[4] 李丽娟，等.靶向二代测序在肺部感染中的应用：临床医生的视角［J］.中国呼吸与危重监护杂志，2024，23（3）：215-220.[5] 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.WS 288 - 2017肺结核诊断[S].北京：中国标准出版社，2017.[6] 罗彬，纪贵娟，何美玲. 支气管灌洗液涂片、结核分枝杆菌培养、实时荧光定量PCR及tNGS对菌阴肺结核的诊断价值［J］.中国医学创新，2025，22（16）:142-146.[7] 张华，戴晓，胡平，等.靶向二代测序与Xpert MTB/RIF检测技术在临床分离株及痰标本中检测结核分枝杆菌的比较［J］.微生物光谱，2024，212（5）：DOI:10.1128/spectrum.04098-23.[8] 王世艳，赵睿桢，张建勇，等. 以肺泡灌洗液行结核/非结核分枝杆菌检测对菌阴肺结核的诊断价值［J］.中国老年学杂志，2024，44（04）：812-815.

关键词

支气管肺泡灌洗液；Xpert检测；tNGS检测；肺结核；临床诊断病例

参考

舒薇，刘宇红.世界卫生组织《2023年全球结核病报告》解读[J].结核与肺部疾病杂志，2024，5（1）：15-19.

齐齐，蔡青山，陈园园，周丽红，等.宏基因二代测序技术对胸内淋巴结结核的诊断价值[J].中国防痨杂志，2024，(S1)：2024.06.30.

张勇，刘姿，李敏，等.靶向二代测序技术在支气管肺泡灌洗液中检测结核分枝杆菌的临床应用［J］.胸腔疾病杂志，2024，16（5）：305-313.

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中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.WS 288 - 2017肺结核诊断[S].北京：中国标准出版社，2017.

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DOI: http://dx.doi.org/10.12345/yzlcyxzz.v9i5.39842